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顯微鏡作為實驗室的常規設備 ,每天可見 ,其應用也非常廣泛 。小到微生物檢測 ,大到產品的外觀檢查 ,覆蓋了各個方麵 。可是 ,對於不同的顯微觀察方式 ,您真的了解嗎 ?在這篇小文中 ,我們就簡單扒一扒不同顯微觀察方式 、優缺點及各自的應用範圍 。
1.明場 BF
作為最常規的觀察方式 ,明場的應用主要在於常規的鏡檢 、組織 、病理切片或者各類染色標本的觀察 。生物學專業的童鞋最熟悉的革蘭氏陽性菌和陰性菌的觀察 ,以及顯微計數等 ,都離不開這種觀察方式 。
明場觀察的優點是視野的亮度高 、均勻 ;而且操作簡單 ,成本不高 。是非常受歡迎的一類觀察方式 。但同時也存在一些缺點 ,比如需要製片 ;物鏡工作距離短無法觀察較厚的樣本等問題 。另外 ,如果是透明標本 ,對比度較低 ,細節不易呈現 。當然 ,這種觀察方式也看不到樣本的立體結構 。
2.暗場 DF
它的特點和明場不同 ,不直接觀察到照明的光線 ,而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線 。因此 ,視場成為黑暗的背景 ,而被檢物體則呈現明亮的像 。一般用於微小粒子 、細菌形態 、透明標本等的觀察 。能夠觀察到極其微小的物體 ,其分辨率可達0.4um ,反差大 。
這種觀察方式不太多見 ,隻能觀察到物體存在 、運動和外部形態等 ,對標本的要求也比較高 。
3.相差觀察 PH
利用被檢物體的光程差進行鏡檢 ,將相位差變為人眼可以分辨的振幅差 。可用於活體細胞觀察 、無色透明活體標本的細微結構等 。一般配置在倒置顯微鏡上 ,是鑒定活體細胞最實用 、最經濟的方法 。可使細胞樣本產生一些立體感 。
但是 ,這種觀察方式需要的光強較高 ,且切片不能太厚 ,需要控製在5~10um 。操作有點麻煩 ,熒光效果不如明場物鏡 。在高倍下會產生光暈 ,影響成像效果 。
4.偏光觀察 POL
偏光觀察的原理是依據波動光學原理觀察和精密測定標本細節,或透明物體改變光束的物理參數 ,以此判別物質結構 。這種觀察方式成像一般非常漂亮 。
但僅適用於具有雙折射性的物質 ,比如礦物質 、化學物品鑒別 ;鑒別纖維 、染色體 、澱粉粒 、晶體 ;植物病理檢驗 、骨骼 、牙齒 ;膽固醇 、神經纖維 、以及毛發等 。
5.微光幹涉 DIC
微分幹涉原理是通過特製的棱鏡將偏振光分解相互垂直 ,強度相等的光束 ,光束在極近的兩點(小於顯微鏡的分辨率)上通過被檢物體 ,從而在相位上略有差別 ,使圖象呈現出立體三維感覺 。這種觀察方式最直接的效果就是產生立體感 。可應用於觀察無色透明活體標本的細微結構 ,立體感好 、分辨率高
無色熒光標本 ,染色標本成像 ,以及用於顯微操作等 。
其缺點是需要的光強較高 ,雙折射物質不能做DIC鏡檢 。細胞培養客戶最關心的細胞觀察 ,需要使用底部為玻璃的器皿進行DIC觀察 。
6.浮雕相稱 IMC
IMC觀察的原理比較簡單 ,利用斜射光照射到標本產生折射 、衍射 ,光線通過物鏡光密度梯度調節器產生不同陰影 ,從而使透明標本表麵產生明暗差異 ,增加觀察對比度 。 這種觀察方式經濟實用 ,不限被觀察樣本的材質 ,可用於塑料皿的觀察 ,調節也很方便 。
可以用於胞質內精子注 、IVF和細胞觀察 。
成像特點是圖像顯示陰影或近似三維結構而不會產生光暈 。可用於雙折射物質的檢測 ,也可用於檢測玻璃 、塑料等培養皿中的細胞 ,但分辨率不如DIC高 。同時Leica專利的物鏡可同時用於明場 、暗場和熒光觀察 ,使用方便 。
7.熒光觀察
什麽是熒光呢 ?熒光就是物質中的電子吸收光的能量由低能狀態轉變為高能狀態 ,再回到低能狀態時釋放出的光 ,是非溫度輻射光——冷光 。即 :物質吸收短波光 ,發射出的長波光 。
顯微鏡下的熒光觀察也是比較常用的觀察方式 。生物學中的熒光探針有三種類型 :自發熒光 、熒光染料以及熒光蛋白 。其中自發熒光一般是天然的 ,無法控製 ,通常是令人討厭的。熒光染料明亮且光譜範圍大 ,相對穩定 ,應用範圍較寬 ,但是用於特異性標記細胞內蛋白時比較困難 ;熒光蛋白的優點包括通過融合目標蛋白可以在活細胞內表達 ;可以作為結構破壞的靶 ;對一些環境參數敏感 ;缺點是波長選擇有限 ,低光穩定性 ,光譜交叉 ,基團相對龐大等 。
熒光探針通常被應用於定位 、研究蛋白間相互作用 、空間結構改變 、細胞環境報道 、基因表達報道等 。對於細胞培養的客戶,熒光通常用於染色區分活細胞和死細胞 ,細胞內成分染色等 。
以上圖片來自於Leica Microsystems 。
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